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532年2月23日，在“伟大的教堂”（Magna Ecclesia）被摧毁后的仅仅数天，皇帝查士丁尼一世决定兴建第三代截然不同的大教堂，较前两所更为宏大雄伟。

查士丁尼一世选用物理学家米利都的伊西多尔( Ἰσίδωρος ὁ Μιλήσιος）和数学家特拉勒斯的安提莫斯 ( Ἀνθέμιος ὁ Τραλλιανός）为建筑师，但安提莫斯在不足一年内逝世。拜占庭史学家普罗科比在《建筑》一书里描述了建造圣索菲亚大教堂的状况：皇帝将帝国各地的物料运送到君士坦丁堡，如以弗所阿耳忒弥斯神庙的古希腊圆柱。大石都是来自远处的采石场，包括埃及的斑岩、色萨利的绿色大理石、博斯普鲁斯海峡地区的黑石及叙利亚的黄石。超过一万人参与建造工作，这所新教堂马上就被认为是重要的建筑，展示了建筑师的创造力。建筑师们采用了希罗的理论，在广大的空间之上建造巨大的圆顶。皇帝与牧首梅纳斯（Μηνάς）在537年12月27日一起参与了盛大的落成仪式。教堂内的镶嵌画则在查士丁二世在位时才完成。

553年8月及557年12月的地震使主圆顶及东面的半圆顶破裂，558年5月7日发生的地震使主圆顶彻底倒塌，破坏了读经台、祭坛及其华盖。皇帝马上下令修复，让米利都的伊西多尔（Isidore of Miletus）的侄子伊西多拉（Isidorus）负责修复工作。他使用了较轻的建材，又将圆顶提高了6.25米，使教堂的内部高度达到现时的55.6米。修复工程在562年完成，使教堂在6世纪的面貌得以保存至今。拜占庭诗人示默者保罗（Paul the Silentiary）为教堂的重建创作了一首名为《读画诗》的长诗。562年12月23日，牧首优迪基乌（Eutychius）主持落成仪式。

726年，拜占庭皇帝利奥三世颁布一系列的诏令抵制偶像崇拜，命令军队摧毁一切圣像，迎来了毁坏圣像运动。圣索菲亚大教堂内的所有宗教画像及雕像被移除。在伊琳娜女皇执政时期（797年－802年），圣像崇拜得到短暂的恢复，此后偶像破坏卷土重来。拜占庭皇帝狄奥菲洛(Theophilos)深受伊斯兰艺术影响，而伊斯兰艺术是禁止偶像崇拜的。他将刻有画押字的青铜两翼门安装在大教堂的南面入口。859年的大火对大教堂造成破坏，而869年1月8日的地震使一个半圆顶倒塌，巴西尔一世下令复修。989年10月25日发生强烈地震，破坏了大教堂的大圆顶，巴西尔二世委托亚美尼亚建筑师、阿尼及阿吉涅大教堂的创造者梯利达特（Trdat）修复圆顶，西面的圆拱及部分大圆顶是他主要的修复部分。大教堂的损毁程度使修复工作持续了六年，大教堂在994年5月13日重新开放。

在第四次十字军东征期间，大教堂被拉丁人洗劫。在拉丁帝国的占领下，圣索菲亚大教堂成为了罗马天主教会的主教座堂。鲍德温一世于1204年5月16日在圣索菲亚大教堂加冕为皇帝，仪式严格遵循拜占庭的传统。威尼斯公爵恩里科·丹多洛被葬在教堂内，碑文显示了他的名字，成为了地面装饰。在19世纪，一个意大利的修复小组在可能的位置附近放置了一个纪念碑标记，经常被误认为是中世纪的文物，今天仍然可见。最初的坟墓在教堂改建为清真寺的过程中被奥斯曼帝国摧毁。

1261年，尼西亚帝国皇帝米海尔八世占领君士坦丁堡后，大教堂已显得相当破败，西面的四道扶壁大概就是在这时加建。1317年，安德洛尼卡二世在教堂东部及北部加建四道扶壁。1344年10月的地震使教堂的圆顶崩裂，部分建筑在1346年5月19日倒塌，教堂在此后关闭。1354年，建筑师阿斯特拉及佩拉尔塔负责教堂的修缮工作。

1452年12月12日，基辅的伊西多尔(Isidore)在圣索菲亚大教堂宣布了人们期待已久的西方天主教和东方东正教的联合，该联合由佛罗伦萨会议(Council of Florence)决定，并由教皇颁布：“Bull of Union with the Greeks”，尽管它将是短暂的。联合在拜占庭人中不受欢迎，他们已经驱逐了君士坦丁堡大牧首格里高利三世，因为他支持联合的立场。直到奥斯曼帝国征服后才任命了新的大主教。根据同时期拜占庭历史学家杜卡斯（Doukas）的说法，圣索菲亚大教堂被这些天主教的联系所玷污，反联盟的东正教信徒们避开了大教堂，认为它是恶魔出没的地方，是古罗马异教的“希腊化”寺庙。杜卡斯还指出，在教皇宣布联合后，罗马人不满地分散到附近的场所，在那里他们向Hodegetria圣像敬酒，根据拜占庭时期的传统，在阿瓦尔汗国和倭马亚哈里发国围攻君士坦丁堡时，Hodegetria圣像曾为他们祈祷并拯救了他们。